​细胞复苏培养实验步骤与注意事项

细胞复苏培养实验步骤与注意事项

细胞复苏是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。当恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反即刻恢复。细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。

细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。

细胞复苏的基本原则

快速融化：细胞复苏过程升温要快，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。

在复苏时，需要快速升温，在 1-2 min 内融化并稀释，这时细胞内外还来不及形成较大的冰晶，也不会使细胞长时间暴露在高浓度的电解质溶液中，从而避免细胞损伤，提高细胞存活率。

避免温度变化：在复苏过程中，应尽量避免温度的剧烈变化，以免对细胞造成额外的压力。

细胞复苏的实验步骤

1. 开启37℃水浴锅。预热完全培养基，提前将细胞从液氮中取出，放于-80℃冰箱，让冻存管中液氮挥发。

2. 洁净工作台内准备15 mL离心管，加入至少5 mL预热的完全培养基。

3. 从-80℃冰箱中取出细胞。快速将冻存管置于37℃水浴锅内，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意：（1) 融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化均匀。晃动时应避免水没过管盖增加污染风险。

（2) 管内冻存液融化至只剩一个约2 mm直径的冰晶时，可停止水浴。继续晃动冻存管至冰晶融化。

4. 用75%酒精消毒冻存管表面。在洁净工作台内小心开盖，尽量避免气泡溢出，轻柔吹打数次，转移至预先准备的离心管内。用少量完全培养基洗涤冻存管1~2次，一并收集至离心管内。

注意：此时细胞比较脆弱，细胞膜表面还未完全恢复，剧烈的吹打会造成细胞活率下降。因此，需要以轻柔的方式稀释细胞冻存悬液。轻柔颠倒混匀，充分稀释冻存液，有条件可以静置1分钟，使细胞恢复渗透压，再进行下一步操作。

5. 250 g离心4 min。离心后去除上清。加入2 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。（如有台盼蓝可取少量细胞悬液进行染色计数）

6. 将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中，加入足量完全培养基，摇匀细胞，将培养容器放入培养箱中培养。

常见培养器皿底面积和加液量参考

注意：添加培养液体积和胰酶添加量仅供参考，特殊细胞可适当进行调整。

7. 复苏次日，观察细胞状态并更换培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。

注意：贴壁/半贴壁细胞接种24 h内不应扰动。部分细胞贴壁较慢，复苏后48 h不应扰动。

细胞复苏的注意事项

1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套，护目镜。如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。

2. 细胞放入水浴中复苏时注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。

3. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

4. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。

5. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染，实验室定期用过氧化氢熏蒸，细胞小黑点增多时用支原体检测试剂盒检测，并且及时清除。

细胞复苏的常见问题

1. 细胞复苏后，细胞数量很少

可能得原因：细胞冻存前活细胞少，状态不佳；细胞解冻速度过慢；细胞冻存悬液在常温下时间太久；未充分稀释冻存液；离心速度不恰当。

解决办法：

确保冻存前细胞状态良好，活细胞比例高。加快解冻速度，尽量减少在常温下的放置时间。确保冻存液充分稀释，避免对细胞造成损伤。调整离心速度，找到最适合细胞的离心条件。

2. 细胞复苏后，很多难以贴壁

解决办法：

检查缓冻快融操作是否规范，避免操作不当导致的损伤。确认冻存前细胞的密度和活率是否适宜。控制好消化时间，避免过长导致细胞贴壁能力下降。

3. 细胞贴壁了，却长不起来

解决办法：

调整细胞密度，尝试将细胞转移到较小的培养器皿中，促进细胞间的相互作用。给予细胞足够的时间来适应培养环境，有些细胞复苏后需要一段时间才能开始生长。确保冻存前细胞状态良好，避免冻存前细胞已处于凋亡状态。

此外，还需注意培养环境的无菌操作，定期检查培养基的成分和pH值，以及确保足够的营养供给和适宜的气体环境（如CO₂浓度）。在处理细胞时，温和操作，避免造成机械损伤。

作者：海星生物

公众号：海星生物科技

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